Swissuniversities (https://www.swissuniversities.ch)

Daniel Renčiuk (Biofyzikální ústav AV ČR, v. v. i.)

48 869,70 CHF

University of Zürich
Institute of Inorganic Chemistry

Krystalizovali jsme, řešili a publikovali čtyři struktury Drew-Dickersonova DNA dodekameru s modifikacemi buď 5-hydroxymetyl cytosinu nebo 5-metyl cytosinu na dvou různých pozicích. Pomocí experimentu tavení UV absorpce jsme určili vliv modifikací cytosinu na tepelnou stabilitu dvojšroubovice DNA. Výsledky této části projektu byly publikovány v prestižním mezinárodním lektorovaném odborném časopise Nucleic Acids Research (doi: 10.1093/nar/gkt738). Výsledky byly také aktivně prezentovány na mezinárodním sympoziu (B. Spingler, 2013, Gordon Conferences, New England, USA).

Pomocí CD spektroskopie jsme zjistili, že Drew-Dickersonův dodekamer netvoří Z-DNA. Tuto část projektu jsme tedy přeskočili.

Během období projektu jsme nebyli schopni získat žádné měřitelné krystaly z (CGG)n sekvencí souvisejících s FRAXA, dokonce ani po intenzivní manuální optimalizaci podmínek. Z této části projektu tedy neexistují žádné kvantifikovatelné výsledky.

Podle toho jsme zahájili další projekt neuvedený v návrhu projektu, který byl zaměřen na studie struktury guaninového kvadruplexu vytvořeného aptamerovou sekvencí vážící trombin. Zahájili jsme automatizovaný screening podmínek krystalizace na třech různých sekvencích DNA. Do této chvíle jsme nezískali žádné měřitelné krystaly.

Projekt je zaměřen na studie neobvyklých sekundárních struktur DNA důležitých z biologického nebo lékařského hlediska. Využívá výhod dvou komplementárních metodologických přístupů: studií konformačních přechodů založených na CD spektroskopii a strukturálních studií s vysokým rozlišením založených na difrakci rentgenových paprsků. Skládá se ze dvou relativně nezávislých problémů:

5-hydroxymetyl cytosin (hmC), velmi diskutované téma současné epigenetiky, byl popsán v minulých několika letech jako “šestá báze” genomu a rovněž se považuje za potenciálního prostředníka v demetylaci cytosinu. Zajímá nás, zda a jak 5-hydroxymetyl cytosin pro substituci cytosinu ovlivňuje strukturu modelové B-DNA oligonukleotidy, Dickersonův dodekamer CGCGAATTCGCG. Difrakcí rentgenových paprsků určíme strukturu s vysokým rozlišením Dickersonova dodekameru obsahující hmC a porovnáme ji s nemodifikovanou sekvencí.

Fragilní X syndrom typu A (FRAXA) je neurodegenerativní porucha u lidí charakterizovaná vícenásobnou expanzí (CGG) tripletu v oblasti 5`UTR genu FMR1. (CGG)n tvoří neobvyklé struktury, které mohou být za tuto nemoc odpovědné: B-podobný homoduplex, kvadruplex nebo Z-DNA. Chceme určit atomové struktury neobvyklého homoduplexu i Z-DNA tvořené buď nemodifikovaným či 5-metyl cytosinem nebo 5-hydroxymetyl cytosinem obsahujícím oligonukleotid.

Projekt bude zahájen ve vysílající instituci, kde budou provedeny předběžné CD a UV experimenty tavení, a pak budou řešeny struktury s vysokým rozlišením tvarů vybraných v této části pomocí rentgenové krystalografie ve švýcarské instituci.